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负压微环境对人脐静脉血管内皮细胞新生的影响及其机制
文献摘要：
目的:探究负压微环境对人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）新生的影响及其机制。方法:采用实验研究方法。取第3~5代对数生长期HUVEC进行后续实验。取3批细胞，各批次细胞均分为常规培养24 h的正常对照组和单纯负压处理组以及加入17-丙烯胺基-17-去甲氨基格尔德霉素（17-AAG）培养24 h的单纯17-AAG组与17-AAG+负压处理组，另采用自行设计研发的全自动三维细胞梯度负压加载装置对2个负压处理组细胞行持续8 h的间歇负压吸引（负压值为-5.33 kPa，吸引30 s、暂停10 s），第1个批次细胞处理完成后于培养0（即刻）、24、48、72 h，采用细胞计数试剂盒8法检测细胞增殖水平，样本数为6；第2个批次细胞处理完成后进行划痕试验，于划痕后12 h，在倒置相差显微镜下观察细胞迁移情况后计算细胞迁移率，样本数为3；第3个批次细胞处理完成后进行小管形成实验，于培养6 h，在倒置相差显微镜下观察成管情况后计算细胞成管总长度与分支节点数，样本数为3。取细胞，分为正常对照组、单纯负压处理组、17-AAG+负压处理组，同前相应组别进行处理，处理完成后，采用蛋白质印迹法检测细胞中热休克蛋白90（HSP90）、窖蛋白1、内皮型一氧化氮合酶（eNOS）、eNOS磷酸化位点1177蛋白表达并计算eNOS磷酸化位点1177/eNOS比值（样本数为3），采用免疫共沉淀（共沉淀HSP90与窖蛋白1、窖蛋白1与eNOS）与蛋白质印迹法检测各组细胞中窖蛋白1、eNOS的蛋白表达（样本数为3），采用免疫荧光双重染色法评估细胞中HSP90与窖蛋白1、窖蛋白1与eNOS的蛋白共定位情况。通过HADDOCK 2.4蛋白质-蛋白质对接程序对窖蛋白1和eNOS进行分子对接预测。数据分析采用析因设计方差分析、单因素方差分析、LSD法。结果:与正常对照组相比，单纯17-AAG组细胞增殖水平于处理完成后培养24、48、72 h均明显降低（
P<0.01），单纯负压处理组细胞增殖水平于处理完成后培养24、48、72 h均明显升高（
P<0.01）；与单纯17-AAG组相比，17-AAG+负压处理组细胞增殖水平于处理完成后培养48、72 h均明显升高（
P<0.05或
P<0.01）；与单纯负压处理组相比，17-AAG+负压处理组细胞增殖水平于处理完成后培养24、48、72 h均明显降低（
P<0.01）。划痕后12 h，与正常对照组的（39.9±2.7）%相比，单纯17-AAG组细胞迁移率明显降低［（10.7±2.7）%，
P<0.01］，单纯负压处理组细胞迁移率明显升高［（61.9±2.4）%，
P<0.01］；与单纯17-AAG组相比，17-AAG+负压处理组细胞迁移率明显升高［（37.7±3.7）%，
P<0.01］；与单纯负压处理组相比，17-AAG+负压处理组细胞迁移率明显降低（
P<0.01）。处理完成后培养6 h，与正常对照组相比，单纯17-AAG组细胞成管总长度明显缩短（
P<0.05）且分支节点数明显减少（
P<0.05），单纯负压处理组细胞成管总长度明显延长（
P<0.01）且分支节点数明显增加（
P<0.01）；与单纯17-AAG组相比，17-AAG+负压处理组细胞成管分支节点数明显增加（
P<0.05）；与单纯负压处理组相比，17-AAG+负压处理组细胞成管总长度明显缩短（
P<0.01）且分支节点数明显减少（
P<0.01）。蛋白质印迹法检测显示，处理完成后，3组细胞中eNOS、窖蛋白1蛋白表达总体比较，差异均无统计学意义（
P>0.05）；单纯负压处理组细胞中HSP90蛋白表达与eNOS磷酸化位点1177/eNOS比值均明显高于正常对照组（
P<0.01），17-AAG+负压处理组细胞中HSP90蛋白表达与eNOS磷酸化位点1177/eNOS比值均明显低于单纯负压处理组（
P<0.01）。处理完成后免疫共沉淀与蛋白质印迹法检测显示，与正常对照组相比，单纯负压处理组细胞中窖蛋白1蛋白表达明显升高（
P<0.01），eNOS蛋白表达明显降低（
P<0.05）；与单纯负压处理组相比，17-AAG+负压处理组处理完成后细胞中窖蛋白1蛋白表达明显降低（
P<0.01），eNOS蛋白表达明显升高（
P<0.01）。处理完成后，与正常对照组相比，单纯负压处理组细胞中HSP90与窖蛋白1的蛋白共定位明显增多，窖蛋白1与eNOS的蛋白共定位明显减少；与单纯负压处理组比，17-AAG+负压处理组细胞中HSP90与窖蛋白1的蛋白共定位明显减少，窖蛋白1与eNOS的蛋白共定位明显增多。分子对接预测提示，窖蛋白1与eNOS相互作用较强，抑制eNOS 1177位点的磷酸化。
结论:负压微环境可能通过促进HUVEC中HSP90结合窖蛋白1进而抑制窖蛋白1结合eNOS，以解除窖蛋白1对eNOS 1177位点磷酸化的抑制，从而促进HUVEC增殖、迁移和成管，最终促进HUVEC新生。
文献关键词：
负压伤口疗法;细胞微环境;HSP90热休克蛋白质类;窖蛋白1;血管内皮细胞;内皮型一氧化氮合酶
中图分类号：
作者姓名：
董禹辰;黄容;赵聪颖;李学拥
作者机构：
空军军医大学第二附属医院烧伤整形科，西安 710038
文献出处：
引用格式：
[1]董禹辰;黄容;赵聪颖;李学拥-.负压微环境对人脐静脉血管内皮细胞新生的影响及其机制)[J].中华烧伤与创面修复杂志,2022(06):520-531
A类：
AAG+,HADDOCK
B类：
人脐静脉血管内皮细胞,HUVEC,实验研究方法,对数生长期,规培,正常对照,烯胺,胺基,去甲,尔德,自行设计,设计研发,负压加载,加载装置,负压吸引,kPa,暂停,理完,即刻,试剂盒,划痕试验,倒置,相差显微镜,显微镜下,移情,细胞迁移率,细胞成管,总长度,分支节点,同前,组别,蛋白质印迹法,HSP90,内皮型一氧化氮合酶,eNOS,磷酸化,免疫共沉淀,免疫荧光双重染色,染色法,共定位,对接程序,分子对接,析因设计,单因素方差分析,LSD,负压伤口疗法,细胞微环境,热休克蛋白质类
AB值：
0.136346
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