[背景]大豆异黄酮主要包括染料木素和大豆苷元,发挥类雌激素样作用,能够清除自由基,促进细胞增殖.颗粒细胞是卵泡内重要的细胞群体,其生理状态与卵巢功能直接相关.颗粒细胞凋亡常引起卵泡闭锁.牦牛是青藏高原特有物种之一,但其繁殖率低,其具体机制尚不明确.卵巢颗粒细胞是研究雌性动物生殖调控机制的理想细胞模型.[目的]探讨大豆异黄酮对牦牛卵巢颗粒细胞增殖和凋亡的影响,为大豆异黄酮的作用机制研究提供依据.[方法]分离培养牦牛卵巢颗粒细胞,FSHR免疫细胞化学染色鉴定,MTT法测定细胞增殖情况,绘制生长曲线;细胞传代后添加不同浓度染料木素或大豆苷元(0,1 000,2 000,3 000,4 000和5 000 pg·mL-1),选择染料木素或大豆苷元最佳作用浓度分别处理二代颗粒细胞48 h,收集细胞培养液,ELISA法检测培养液中雌二醇(E2)和孕酮(P4)浓度;同时收集细胞,提取总RNA,实时荧光定量PCR法检测细胞增殖相关基因AKT1和细胞凋亡相关基因Bcl-2、Bax、Bad、Fas、FasL、Caspase-3和p53的表达水平.[结果]牦牛卵巢颗粒细胞呈典型的上皮样细胞生长特性.接种后2 h开始贴壁,12 h出现聚集生长;24 h细胞体积较大,呈长梭形、星形或多边形;48 h细胞呈"铺路石"样单层排布;卵巢颗粒细胞特异标志蛋白FSHR免疫细胞化学染色阳性,表明,分离培养的是卵巢颗粒细胞;MTT法检测细胞增殖情况,牦牛卵巢颗粒细胞呈"S"形曲线生长:培养24 h内生长缓慢,处于潜伏生长期;24-48 h细胞增殖较快,进入指数生长期;48-120 h细胞平稳增殖,处于平顶期;120 h后活细胞密度开始下降,细胞进入退化衰亡期;第二代细胞生长较快,24 h进入指数增殖期,故试验选择第二代颗粒细胞进行.MTT法检测不同浓度染料木素或大豆苷元对细胞增殖的影响,结果,添加3 000 pg·mL-1染料木素或大豆苷元作用48 h后,细胞活力均极显著增强(P＜0.01);染料木素和大豆苷元均促进颗粒细胞分泌雌二醇,大豆苷元促进效果显著(P＜0.05);染料木素显著抑制颗粒细胞分泌孕酮(P＜0.05);qRT-PCR结果显示,染料木素和大豆苷元均显著上调颗粒细胞增殖调控相关基因AKT1和凋亡相关基因Bcl-2、Bax、p53和Fas的表达(P＜0.01),显著下调凋亡相关基因Ba.d和FasL的表达(P＜0.01),并显著上调Bcl-2/Bax比值(P＜0.01)抑制细胞凋亡.此外,染料木素抑制Caspase-3表达(P＜0.01)而大豆苷元促进Caspase-3表达(P＜0.01).[结论]分离培养了牦牛卵巢颗粒细胞,为牦牛雌性生殖调控机制研究提供了有效的细胞模型.试验结果表明,染料木素和大豆苷元抑制牦牛颗粒细胞分泌孕酮,促进细胞增殖,且主要通过上调Bcl-2、p53、Fas和 Bcl-2/Bax,以及下调Bad和FasL的表达,保护卵巢颗粒细胞免于凋亡.

染料木素;大豆苷元;牦牛;卵巢颗粒细胞;增殖;凋亡

阿依木古丽·阿不都热依木;阿尔祖古丽·阿依丁;王家敏;石嘉琛;马芳芳;蔡勇;乔自林

西北民族大学生物医学研究中心甘肃省动物细胞技术创新中心,兰州730030;西北民族大学生命科学与工程学院,兰州730030;西北民族大学生物医学研究中心生物工程与技术国家民委重点实验室,兰州730030;西北民族大学实验教学部,兰州730030

中国农业科学

[1]阿依木古丽·阿不都热依木;阿尔祖古丽·阿依丁;王家敏;石嘉琛;马芳芳;蔡勇;乔自林-.大豆异黄酮对牦牛卵巢颗粒细胞增殖和凋亡的影响)[J].中国农业科学,2022(08):1667-1675

大豆异黄酮,牦牛,卵巢颗粒细胞,颗粒细胞增殖,增殖和凋亡,染料木素,大豆苷元,雌激素样作用,清除自由基,生理状态,卵巢功能,颗粒细胞凋亡,卵泡闭锁,青藏高原,特有物种,繁殖率,具体机制,雌性动物,生殖调控,调控机制,细胞模型,分离培养,FSHR,免疫细胞化学染色,MTT,生长曲线,传代,pg,最佳作用浓度,别处,细胞培养,培养液,雌二醇,E2,孕酮,P4,AKT1,凋亡相关基因,Bcl,Bax,Bad,FasL,Caspase,p53,上皮样,细胞生长,生长特性,贴壁,细胞体,星形,多边形,铺路石,层排,排布,伏生,生长期,平顶,活细胞,细胞密度,衰亡,第二代,增殖期,细胞活力,促进效果,qRT,细胞增殖调控,免于

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