为同时制备B型流感病毒RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)各亚基(PB1、PB2、PA)的单克隆抗体(MAb),本研究利用融合有flag标签的鼠源酸性核磷酸蛋白32B羧基末端结构域[muANP32B(111-C)-flag]与RdRp之间特异性的强亲和作用,将表达IBV RdRp各亚基(PB1、PB2、PA)的质粒与表达鼠muANP32B(111-C)-flag的质粒共转染ANP32A/ANP32B双敲除的293T细胞(DKO细胞),36 h后通过免疫沉淀(IP)试验,富集并纯化RdRp(由PB1、PB2、PA亚基组成),经SDS-PAGE检测获得了纯度较高的ANP32B(111-C)-RdRp复合物.以纯化的该复合物免疫BALB/c小鼠,通过间接ELISA方法筛选能稳定分泌IBV RdRp和ANP32B(111-C)特异性MAb的杂交瘤细胞株.利用western blot鉴定各杂交瘤细胞株分泌MAb所结合的RdRp亚基.从获得的各种MAb中分别选取效价最高的1株制备小鼠腹水,利用间接ELISA方法测定各腹水的效价.将表达A、B、C、D型流感病毒RdRp各亚基(PB1、PB2、PA)的质粒分别转染293T细胞,24 h后裂解细胞,利用所制备的RdRp各MAb经western blot鉴定其交叉反应性;分别将表达不同物种ANP32B蛋白的质粒转染DKO细胞,24 h后利用制备的muANP32B(111-C)MAb经western blot鉴定.上述试验结果显示,共筛选到27株阳性杂交瘤细胞.Western blot结果显示,获得了多株稳定分泌PB1亚基、PB2亚基、PA亚基及muANP32B(111-C)MAb的杂交瘤细胞株;间接ELISA结果显示,上述各类MAb制备的小鼠腹水最高效价为1∶1.28×105～1∶6.4×104,分别命名为1D10、1E9、2E9、6C7.Western blot结果显示,制备的IBV RdRp各单亚基MAb均能与IBV RdRp对应单亚基蛋白发生特异性反应,而不与A、C、D型流感病毒RdRp对应的单亚基反应,表明各MAb对IBV的特异性较强;其中MAb 6C7可以识别鼠、人、鸡、牛、猪、犬的ANP32B蛋白及鸡的ANP32A蛋白,表明该MAb的物种广谱性较好,可用于不同物种ANP32蛋白的检测.将MDCK细胞感染IBV,并分别以转染IBV RdRp各亚基质粒的293T细胞作为阳性对照;培养鼠源SP2/0细胞,并以转染muANP32B质粒的DKO细胞作为阳性对照,利用制备的MAb分别经激光共聚焦试验检测病毒RdRp各亚基在MDCK细胞及muANP32B在SP2/0细胞中的定位.结果显示,各MAb均能够与细胞中病毒RdRp各单亚基及SP2/0细胞中的内源性muANP32B蛋白反应,出现相应荧光.且PB1、PA亚基及内源性muANP32B主要定位在细胞质,PB2亚基主要定位在细胞核.本研究首次利用ANP32(111-C)蛋白富集IBV RdRp,并采用免疫ANP32(111-C)-RdRp复合物的方式同时获得了针对IBV RdRp3个亚基和ANP32(111-C)蛋白的4株Mab,且能识别出多种与IBV感染相关的关键互作蛋白,可为IBV相关研究及检测提供有效的技术支持.

B型流感病毒;RNA依赖性RNA聚合酶;ANP32蛋白;单克隆抗体

纪玉洁;郭兴;张振宇;王晓钧

中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/马传染病和慢病毒病研究创新团队,黑龙江 哈尔滨 150069

中国预防兽医学报

[1]纪玉洁;郭兴;张振宇;王晓钧-.基于ANP32蛋白的B型流感病毒聚合酶的纯化及其单克隆抗体的高效制备)[J].中国预防兽医学报,2022(02):162-168

ANP32,muANP32B,ANP32A,ANP32B,1D10,1E9,2E9,6C7,RdRp3,Mab

流感病毒,单克隆抗体,高效制备,PB1,PB2,MAb,研究利用,flag,羧基,结构域,IBV,共转染,敲除,293T,DKO,免疫沉淀,亚基组成,SDS,PAGE,复合物,BALB,杂交瘤细胞株,western,blot,效价,腹水,交叉反应性,质粒转染,多株,白发,白及,广谱性,MDCK,细胞感染,阳性对照,SP2,共聚,试验检测,内源性,细胞质,细胞核,互作蛋白

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