为建立检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪δ冠状病毒(PDCoV)和猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)的多重荧光定量RT-PCR方法,本研究针对PEDV、PDCoV、SADS-CoV的M基因、M基因、N基因序列保守区分别设计特异性引物/探针,经各反应条件优化后,建立了检测PEDV、PDCoV、SADS-CoV的多重荧光定量RT-PCR方法.特异性试验结果显示,该方法仅对PEDV、PDCoV、SADS-CoV检测为阳性,对猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪瘟病毒和口蹄疫病毒等的核酸检测均为阴性.敏感性试验结果显示,该方法对PEDV、PDCoV、SADS-CoV重组质粒标准品的检测下限均为1.0×101拷贝/μL,且在101拷贝/μL～106拷贝/μL范围内各重组质粒均与各自的Ct值有良好的线性关系.重复性试验结果显示,批内、批间重复性试验的变异系数均在0.33％～2.53％,重复性和稳定性均较好.利用建立的多重荧光定量RT-PCR方法对采自河南各地的100份临床样品进行检测,并与3种病毒的单一RT-PCR检测方法、相应病毒的标准检测方法(由于SADS-CoV无标准检测方法,则采用RT-PCR扩增后测序并经NCBI BLAST比较分析测序结果)进行比较分析,以评估本实验建立检测方法的临床应用效果.多重荧光定量RT-PCR结果显示,PEDV、PDCoV、SADS-CoV的阳性率分别为38％(38/100)、14％(14/100)、5％(5/100),不存在混合感染现象,与PEDV、PDCoV标准检测方法的符合率为100％,且敏感性高于单一RT-PCR方法.本研究首次建立了一种特异、敏感、快速的多重荧光定量RT-PCR方法,可以用于PEDV、PDCoV、SADS-CoV的鉴别检测,为猪腹泻类疫病鉴别诊断及防控奠定基础.

猪流行性腹泻病毒;猪δ冠状病毒;猪急性腹泻综合征冠状病毒;荧光定量RT-PCR;检测方法

刘影;闫若潜;杨海波;王淑娟;赵雪丽;谢彩华;柴茂;王东方

河南省动物疫病预防控制中心河南省重大动物疫病监测预警及防控重点实验室,河南 郑州 450008

中国预防兽医学报

[1]刘影;闫若潜;杨海波;王淑娟;赵雪丽;谢彩华;柴茂;王东方-.猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒多重荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用)[J].中国预防兽医学报,2022(11):1189-1195

猪流行性腹泻病毒,猪急性腹泻综合征冠状病毒,建立及应用,PEDV,PDCoV,SADS,基因序列,特异性引物,反应条件优化,猪传染性胃肠炎病毒,猪轮状病毒,猪繁殖与呼吸障碍综合征,猪伪狂犬病毒,猪圆环病毒,猪细小病毒,猪瘟病毒,口蹄疫病毒,核酸检测,敏感性试验,重组质粒,标准品,检测下限,拷贝,Ct,重复性试验,后测,NCBI,BLAST,临床应用效果,混合感染,符合率,首次建立,鉴别检测,猪腹泻,鉴别诊断

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