典型文献
山羊Zfy基因克隆分析及其敲除载体构建
文献摘要：
旨在对西农萨能奶山羊Zfy基因进行克隆和生物信息学分析,并利用CRISPR/Cas9技术成功获得敲除Zfy基因的奶山羊成纤维细胞株,为进一步探索Zfy基因功能及性别调控提供基础数据.本研究以健康的西农萨能奶山羊为对象,采集3只3月龄公山羊睾丸组织并提取总RNA.根据NCBI中预测的山羊Zfy基因mRNA序列信息(GenBank登录号:XM_018044893)设计引物,利用RT-PCR技术分段克隆获得山羊Zfy基因序列,使用相关生物信息学软件分析Zfy基因CDS区核苷酸序列并预测其蛋白质的结构和功能.针对山羊Zfy基因CDS区共设计了4条sgRNA,构建4个打靶载体并转染山羊胎儿成纤维细胞(GFFs),利用T7E1酶切检验打靶载体的切割效率,通过嘌呤霉素筛选敲除Zfy基因的GFFs阳性单克隆细胞,经PCR扩增、测序检测突变率.结果显示,成功克隆得到了长度为2 406 bp的西农萨能奶山羊Zfy基因CDS区序列.同源性以及系统进化树分析表明,山羊Zfy基因序列与马鹿、牛、绵羊的同源性高,亲缘关系较近,与小鼠的同源性最低,亲缘关系最远.生物信息学软件分析显示,山羊Zfy基因共编码801个氨基酸,分子质量为90.37 ku,Zfy蛋白含66个磷酸化位点,等电点为5.66,亲水性较高,无信号肽,是一个结构不稳定的非分泌蛋白.T7E1酶切发现,4个打靶载体均可发挥敲除活性,切割效率分别为12.31％、40.86％、31.52％、26.37％.选择切割效率最高的打靶质粒转染山羊胎儿成纤维细胞(GFFs),经嘌呤霉素筛选获得能稳定靶向敲除Zfy基因的GFFs阳性细胞株,PCR测序检测突变率为23.91％.综上所述,本研究成功克隆了西农萨能奶山羊Zfy基因并揭示了该基因所编码蛋白的理化性质;成功构建了山羊Zfy基因CRISPR/Cas9敲除载体,并筛选出最佳敲除位点,获得了Zfy基因敲除的亚克隆细胞,为深入研究山羊Zfy基因功能及开发性别控制技术奠定了基础.
文献关键词：
Zfy基因克隆;西农萨能奶山羊;生物信息学分析;基因敲除
中图分类号：
作者姓名：
黄敏;谢晓刚;何琪富;曹旭阳;董翔宸;康健;刘军;权富生
作者机构：
西北农林科技大学动物医学院,杨凌712100;杨凌职业技术学院动物工程分院,杨凌712100
文献出处：
引用格式：
[1]黄敏;谢晓刚;何琪富;曹旭阳;董翔宸;康健;刘军;权富生-.山羊Zfy基因克隆分析及其敲除载体构建)[J].畜牧兽医学报,2022(03):711-721
A类：
Zfy,GFFs
B类：
基因克隆,敲除载体,载体构建,西农萨能奶山羊,生物信息学分析,CRISPR,Cas9,成纤维细胞,细胞株,基因功能,月龄,公山,睾丸组织,NCBI,序列信息,GenBank,登录号,XM,引物,基因序列,生物信息学软件,CDS,结构和功能,sgRNA,打靶,胎儿,T7E1,切割效率,嘌呤霉素,单克隆细胞,突变率,bp,同源性,系统进化树分析,马鹿,绵羊,亲缘关系,最远,分子质量,ku,磷酸化,等电点,亲水性,信号肽,非分,分泌蛋白,质粒转染,靶向敲除,阳性细胞,综上所述,编码蛋白,基因敲除,亚克,开发性,性别控制
AB值：
0.231274
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